天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒
211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒，產品簡介：產品品牌：天凈沙產品名稱：可調式易錯 PCR 試劑盒產品貨號：211216-100產品規格：100次
天凈沙211216-100可調式易錯 PCR 試劑盒
北京天凈沙基因科技有限公司，是一家聚焦科研試劑、動物檢驗檢疫、分子診斷的研發和生產企業。
211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒，產品簡介：
產品品牌：天凈沙
產品名稱：可調式易錯 PCR 試劑盒
產品貨號：211216-100
產品規格：100次
211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒
產品及特點
易錯PCR（Error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的特性，在一定條件下（如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在）能夠按較高的機率引入隨機引入突變。如果有適當的選擇方法，則可從構建的突變庫選出所需突變體。本產品是在本公司的易錯PCR試劑盒的基礎上改進而得，本
產品具有下列特點：
1. 即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學研究領域顯示出了它的*性。
2. 配方經過精心優化，實驗人員在一定范圍內可以控制突變率，一輪PCR的突變率范圍在2-8突變/1000bp，更高的突變率可以通過多輪PCR達到。
3. 可用于連續易錯PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯PCR的產物用作下一次易錯PCR的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益突變。
4. 可以擴增的DNA片段更長，達到2kb，對于2kb以上的產物，建議分段擴增。
5. 本試劑盒足夠100次30uL體系的易錯PCR。
6. 本產品只能用于科研。
規格及成分
本產品采用五孔盒包裝
成份 | 編號 | 規格 | 包裝材料 |
可調易錯PCR專用 Taq DNA聚合酶（5U/uL） | 101005c | 50 uL | 0.5mL紅蓋管 |
5×可調易錯PCR Mix（含dNTP | 211216a | 600 uL | 0.5mL黃蓋管 |
可調易錯PCR專用MnCl2 | 211216c | 300 uL | 0.5mL紫蓋管 |
可調易錯PCR專用dGTP | 211216d | 300 uL | 0.5mL藍蓋管 |
10×可調易錯PCR追加dNTP | 211216e | 300 uL | 0.5mL本色管 |
使用手冊 | 211216sc | 1份 | 無 |
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存, 有效期為一年
自備試劑
引物、DNA模板、常規PCR試劑盒
使用方法
1. 將引物稀釋到10uM。引物也是決定易錯PCR成敗的關鍵因素，設計引物時要保證其Tm在70℃，長度在25-30nt之間，GC含量在45%-60%之間，3端GC含量低，并且沒有發夾結構。
2. 用自備易錯PCR引物和自備的常規PCR試劑擴增制備易錯DNA模板（常規PCR產物），膠回收并準確確定濃度。注意：易錯PCR的模板一定要用膠回收的常規PCR產物，因為膠回收會可以把電泳不可見的非特異性擴增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯PCR引物擴增所得，在易錯PCR擴增時也會被擴增，產生競爭抑制，降低靶分子的擴增效率。
3. 將回收的DNA片段（模板）稀釋到1ng/uL 、10ng/uL和100ng/uL三個濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板DNA為非突變DNA，擴增產生的DNA為突變DNA，易錯PCR體系最終DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，則突變DNA在終產物中的相對比例就越低，突變率就越低。故建議同時測試三個模板用量。如果都成功，則優先選用模板濃度低的PCR產物進行分析。
4. 根據每1000bp的預期突變數按下表確定30uL易錯PCR體系中MnCl2和dGTP的用量（這是在模板DNA不超過1ng的前提下的數據）。表中的Mn表示可調易錯PCR專用的MnCl2, dG表示可調易錯PCR專用的dGTP：
預期突變數 | 2個 | 3個 | 4個 | 5個 | 6個 | 7個 | 8個 |
Mn用量（uL） | 0 | 1.0 | 2.5 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
dG用量（uL） | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
5. 設置30uL體系的可調易錯PCR：第一次建議設置3個模板濃度。在3干凈的PCR管中，分別加入下列成分。最后加可調易錯PCR專用MnCl2
成分 | 模板用量1 | 模板用量2 | 模板用量3 |
可調易錯PCR Mix, 5× | 6 uL | 6 uL | 6 uL |
可調易錯PCR 專用dGTP | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 |
自備DNA模板 | 1 uL （1ng/uL） | 1 uL （1ng/uL） | 1 uL （1ng/uL） |
自備PCR引物 (10 uM each) | 1 uL each | 1 uL each | 1 uL each |
可調易錯PCR專用 Taq DNA聚合酶 | 0.5 uL | 0.5 uL | 0.5 uL |
可調易錯PCR 專用MnCl2 | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 |
自備超純水 | 補水到30uL | 補水到30uL | 補水到30uL |
6. 按已經優化的常規PCR條件進行易錯PCR：
PCR前變性 | 94℃ 3分鐘 |
易錯PCR(循環30-60次 | 94℃ 1分鐘 |
60℃ 1分鐘 | |
72℃ 3-10分鐘 |
注：由于易錯PCR含高濃度的鎂離子，因此容易形成引物二聚體，因此需要使用較高的復性溫度，以避免小片段擴增產物競爭性抑制PCR。易錯PCR一般不需要熱啟動，也不需要在易錯PCR結束后做延伸處理。易錯PCR循環次數越多，突變DNA（擴增產物）與非突變DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴增次數越多，發生突變的絕對數就越高，在同一模板上發生的突變位點數就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7個循環數的比較
7. 易錯PCR結束后，取3uL進行電泳檢查。
8. 如果有預期大小的PCR產物，則全部電泳，進行膠回收，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的DNA為模板，再進行下一輪易錯PCR。
9. 如果沒有預期大小的PCR產物，可以按下列操作追加進行一輪常規PCR（追加PCR）。
10. 在PCR管中，加入3uL 10×可調易錯PCR專用追加dNTP到27uL電泳剩下的PCR體系中，按下表進行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循環。
步驟 | 參數 | 循環數 |
追加PCR | 94℃ 1分鐘 | 循環20次 |
60℃ 1分鐘 | ||
72℃ 1分鐘 |
11. 追加PCR結束后，再電泳檢測。如果有條帶，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的DNA為模板，再進行下一輪易錯PCR。
12. 如果沒有預期大小的PCR產物，則需要分析原因
疑難解答
Q：現象：沒有PCR產物。
A：可能原因：一是引物沒有優化，可以重新設計引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不純，最好先膠回收；四是DNA溶液中有EDTA，可以適當補加Mg++。
Q：現象：太多的PCR條帶或PCR條帶模糊一片。
A：可能原因：一是模板有膠回收、二是PCR循環數太多；三是復性溫度太低；四是引物沒有優化；五是PCR條件沒優化，可以使用touch-down PCR。
Q: 如果需要更高的突變率，如何辦？
A: 可以使用連續多次易錯PCR來提高突變率。但最好先用膠純化回收易錯PCR片段,再用于下一輪易錯PCR。
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