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NobleRyder RIPA裂解液(弱)

  • 型   號:P4811
  • 價   格:
  • 更新時間:2024-09-26
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

NobleRyder RIPA裂解液(弱) 即用型液體試劑 P4811-100ml

RIPA裂解液(弱)

產(chǎn)品簡介:

多種成分均可從細胞中提取總蛋白,如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(弱) (Weak RIPA Lysis Buffer )是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可用于PAGE電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。

NobleRyder Weak RIPA Lysis Buffer主要由Tris NP-40、sodium deoxycholate等組成,并含有多種蛋白酶抑制劑成分,可以有效抑制蛋白的降解,并維持原有的蛋白間相互作用。

 NobleRyder RIPA裂解液(弱) 

產(chǎn)品組成:

                    編號

名稱

P4811

Storage

Weak RIPA Lysis Buffer

100ml

-20℃

PMSF(100mM)

1.5ml

-20℃

使用說明書

1份

  

操作步驟(僅供參考)

(一)貼壁培養(yǎng)細胞

1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。

2.去除貼壁細胞的培養(yǎng)液,用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次,低速離心,棄上清,留取沉淀。

3.按照6孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例, 加入Weak RIPA Lysis Buffer。移液器輕輕吹打,使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解,通常裂解液作用于細胞1~3s內(nèi),細胞就會被裂解。通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200~250μl。

4.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。

5.后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細胞

1.取Weak RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻后,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。

2.低速離心懸浮細胞,棄上清,收集沉淀。

3.用手指輕彈細胞,使其松散。按照6孔板每孔細胞加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例,加入Weak RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200~250μl。再用手指輕彈以充分裂解細胞,充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。

4.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。

5.進行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室溫溶解混勻后,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。

2.把組織jian切成細小的碎片,越小越好。

3.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。

4.按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例,加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15~30min。

步驟3、4亦可以采用如下過程:按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。

5.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。

6.進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 

注意事項:

1.去除貼壁細胞的培養(yǎng)液后,如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不用清洗。

2.如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。

3.如果細胞量較多,必需分裝成50~100萬細胞/離心管,然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分,而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸,相對比較容易裂解充分。

4.如果組織樣品本身非常細小,可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,通過強烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便,不必使用勻漿器,缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時,應(yīng)盡量縮短溶解時間,避免有效成分失效。

6.裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗;如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如NF-KB、p53等時,通常不必進行超聲處理,就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

7.細胞裂解的操作步驟,應(yīng)置于冰上或4℃進行。

 

有效期: 12個月有效。

NobleRyder RIPA裂解液(弱) 

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