固定包埋組織DNA快速提取試劑he 核酸提取
福爾馬林固定或者石蠟包埋組織通過du特裂解液熱處理和蛋白酶K共同作用迅速裂解細胞釋放出基因組DNA，然后基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。固定包埋組織DNA快速提取試劑he 核酸提取
固定包埋組織DNA快速提取試劑盒（離心柱型）
固定包埋組織DNA快速提取試劑he 核酸提取
目錄號：40312
v 適用范圍：
適用于快速提取各種福爾馬林固定和石蠟包埋組織DNA
v 試劑盒組成、儲存、穩定性：
試劑盒組成 | 保存 | 50次 | 100次 | 200次 |
裂解液FTL | 室溫 | 11ml | 20ml | 40ml |
結合液CB | 室溫 | 11ml | 20ml | 40ml |
抑制物去除液IR | 室溫 | 25ml | 50ml | 100ml |
漂洗液WB | 室溫 | 15ml | 25ml | 50ml |
第一次使用前按說明加指ding量乙醇 | ||||
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 15ml | 15ml | 15ml×2 |
蛋白酶K fen （可選）30mg/ml | -20℃ | 20+10mg | 3×20mg | 6×20mg |
吸附柱AC | 室溫 | 50個 | 100個 | 200個 |
收集管（2ml） | 室溫 | 50個 | 100個 | 200個 |
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果
儲存事項:
1. 結合液CB或者抑制物去除液IR低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 為避免降低活性、方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，10mg/20mg加入0.5ml/1ml滅菌水溶解，因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。
3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
v 產品介紹：
福爾馬林固定或者石蠟包埋組織通過du特裂解液熱處理和蛋白酶K共同作用迅速裂解細胞釋放出基因組DNA，然后基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。
v 產品特點：
1. 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3. 快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。
多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可達30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。
v 注意事項：
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2. 需要自備乙醇（需要準備100%/80%/60%/40%不同濃度）或者二甲苯。
3. 實驗前將需要的水浴先預熱到37℃備用。
4. 結合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保批pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。
v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 將組織切片放入離心管子，浸泡在二甲苯中脫蠟約30分鐘（具體時間根據切片厚度調整）。
2. 將切片依次放入100%乙醇/80%乙醇/60%乙醇/40%乙醇/去離子水，每個液體中浸泡10秒鐘重新水化切片。
剛放入100%乙醇時，應該見到切片變白。
3. 顯微鏡觀察下，用刀片切下擬提取DNA的目標組織，放入預先稱重的1.5ml離心管。再次稱重，計算出切片組織重量。
4. 在25-50mg組織中加入200μl裂解液FTL,再加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立即混勻混勻后置37℃水浴過夜。
5. 再加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，混勻后55℃水浴1-2小時。
此步驟后，不應該見到粗大的組織顆粒了。
6. 加入200μl 結合液CB，立刻渦旋振蕩20秒充分混勻后置70℃水浴10分鐘。
7. 冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩30秒充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
8. 用1毫升的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
如果有不溶組織物可能堵住槍頭，可將槍頭在吸水紙上輕蹭去除不溶物；如果吸上來的混合物少則可以將槍頭和不溶物一起棄去，該做法是為了去除不溶物，以免堵塞離心柱。。
9. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
10. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
11. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
12. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
13. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。
14. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。
v 附錄：另外一種脫蠟方式
1. 將目標組織切片放入離心管，加入1ml 100%二甲苯，渦旋振蕩10秒。瞬間離心把組織全部浸入到二甲苯。
2. 50℃水浴3分鐘熔解石蠟，20-25℃最高速離心2分鐘，收集組織到管底。
3. 小心用移液器吸棄上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。
4. 加入1ml無水乙醇，渦旋振蕩，最高速離心2分鐘，小心吸棄上清乙醇。
5. 加入1ml無水乙醇，重復步驟6一遍，盡可能吸棄所有乙醇。
6. 室溫或者37℃ 晾干乙醇10分鐘或直到所有乙醇揮發干。
v 問題與解決方法：
問題 | 評論與建議 |
DNA產量低 | *組織塊太大，蛋白酶K消化不wan全-建議：液氮研磨或者盡量將組織切成小塊，或者延長蛋白酶K消化時間至過夜或者在原有消化基礎上另加20μl蛋白酶K消化1-2小時。 *蛋白酶K失效了-建議：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分裝凍存，避免反復凍融。 *裂解不wan全或者和異丙醇沒有充分混勻-建議：加入結合液后，和加入蛋白酶K后立即吹打或者渦旋混勻；加入異丙醇后立即吹打或者渦旋混勻才加入吸附柱，如果太粘稠必須渦旋振蕩15秒充分混勻。 |
組織DNA 降解了 | *組織中核酸酶活性導致降解-建議：樣品處理前妥善保存在－20℃，處理量不要過量。 |
未提取到DNA | *漂洗液WB中忘記加無水乙醇-建議：第一次實驗時，在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇。 |
洗脫下來的 DNA產量低 | *離心柱殘留有較多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建議：確保做了步驟12，否則殘留乙醇會影響洗脫效率。 *使用了水或者其它非優良液體代替洗脫緩沖液-建議：仔細閱讀仔細閱讀注意事項5和步驟13和只使用洗脫緩沖液EB洗脫。 |
A260吸光值 異常偏高 | *一些硅基質膜成分一起洗脫下來，干擾了吸光值-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 |
DNA下游酶切 不能切開或者 酶切不wan全 | *一些硅基質膜成分一起洗脫下來，抑制了酶切反應-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 *離心柱殘留有較多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反應-建議：確保做了步驟7，然后空氣中晾幾分鐘，讓殘留乙醇揮發。 |
固定包埋組織DNA快速提取試劑he 核酸提取
